- 王登峰;李建军;吴建勇;杨学云;高攀;韩博;王治才;
为研究牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的产生和可能的流行趋势,使用EBURST对多位点测序分型(MLST)数据库中的牛源金黄色葡萄球菌、牛源MRSA和医源MRSA进行比较分析。结果显示,国外的牛源mecA+MRSA为CC97(ST1623和ST1624)、CC5(ST5)、CC59(ST87)、CC509(ST89)及单独的序列型(ST1622和STST1625);牛源金黄色葡萄球菌中25.25%和12.54%的分别属于CC97和CC705,但仍有一半以上的菌株分布在众多、较小的克隆复合群中。同时,本实验室对我国5株SCCmecⅣ型和1株未分型MRSA、28株非mecA基因介导的MRSA和11株甲氧西林敏感(MSSA)菌株的MLST分型分析显示,我国mecA+MRSA分布在CC97、5、6和CC9 4个克隆复合群(CCs)中,6株MSSA属于CC97,新发现的28株mecA-MRSA菌株的序列型(STs)为ST121、120、398、97、2154、25、20和938。对以上数据的分析表明,目前,MLST数据库中所有牛源mecA+MRSA可能均由MSSA获得SCCmec而产生,且相对于特定的医源MRSA(mecA+)菌株的快速扩散而导致在某一区域形成大规模流行的现状,牛源MR-SA可能仍在形成流行的早期,已形成的MRSA尚未大范围扩散,但有可能沿着医源MRSA的流行模式发展;并且遗传多样性使金黄色葡萄球菌表面抗原异质化,导致金黄色葡萄球菌性奶牛乳腺炎疫苗的研制较为困难。
2013年04期 v.43;No.428 331-338页 [查看摘要][在线阅读][下载 604K] [下载次数：191 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 张连梅;赵兴绪;张勇;张海容;胡俊杰;武小虎;徐燕霞;胡少辉;周长卿;阚威;
运用生化鉴定及大肠杆菌基因保守序列对引起奶牛乳腺炎的大肠杆菌进行分离鉴定,通过ERIC-PCR、RAPD以及大肠杆菌种类进化群判定标准对其进行种系分群,应用SPSS 17.0软件对ERIC-PCR及RAPD扩增图谱进行聚类分析,探讨不同地区分离的大肠杆菌之间的基因相似性。结果显示,共分离出大肠杆菌13株,根据种系进化群判定标准,该地区A群占61.54%,D群占44.4%,B2群占7.69%。聚类分析显示,ERIC-PCR体系将13株大肠杆菌分为3个聚类群,Ⅰ型7株(占53.85%),Ⅱ型4株(占30.77%),Ⅲ型2株(占15.38%),其中青海省民和县80%的菌株属于Ⅰ型,甘肃省永登县、临洮县及青海省民和县71.43%的菌株属于Ⅱ型和Ⅲ型。RAPD体系将13株大肠杆菌分为2个聚类群,Ⅰ型7株(占53.85%),Ⅱ型6株(占46.15%),其中宁夏区吴忠市的菌株属于Ⅰ型,甘肃省永登县、临洮县及青海省民和县的菌株属于Ⅱ型。基因相似性研究结果显示,以甘肃省兰州市为中心,位于东北方向的宁夏区吴忠市与西南方向的其他3个地区分离菌株的基因相似性存在一定的差异。
2013年04期 v.43;No.428 339-344页 [查看摘要][在线阅读][下载 678K] [下载次数：431 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：3 ] - 高珊珊;蒋毅;黄璐璐;林焱;陆承平;刘永杰;
为了解南京地区犬流感病毒的亚型,采集17只具有呼吸道症状犬的鼻咽拭子,接种SPF鸡胚分离病毒,并对分离株进行亚型鉴定和序列分析。结果,获得2株犬流感病毒,其半数鸡胚感染量(EID50)分别为10-4.54/0.1mL和10-1.42/0.1mL;血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因序列分析显示,2株病毒与已报道的所有H3N2亚型犬流感病毒相应序列的同源性在98%以上,但个别抗原位点有突变;遗传演化分析显示,2株病毒与近年来从犬和猫分离的犬流感病毒中国分离株及韩国分离株的亲缘关系均较近,位于同一进化分支。
2013年04期 v.43;No.428 345-350页 [查看摘要][在线阅读][下载 1424K] [下载次数：277 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 刘凯;孟丽军;张亮;黄小波;文心田;曹三杰;
采用RT-PCR和重叠PCR方法分别扩增出日本乙型脑炎病毒PrMΔE基因和tPA信号肽序列,并将其插入载体pVAX1,将纯化后的重组质粒转染COS-7细胞,用间接免疫荧光法检测质粒在细胞中的瞬时表达情况,并用制备的质粒免疫昆明小鼠,检测其特异性血清IgG抗体水平、促脾淋巴细胞增长率及攻毒保护率。结果显示,真核表达质粒pVAX-tPA-PrMΔE构建成功;间接免疫荧光试验显示,该质粒在COS-7细胞中的表达产物可与鼠抗日本乙型脑炎病毒单克隆抗体发生特异性反应,tPA信号肽序列能明显增强PrMΔE基因DNA疫苗的免疫原性,显著提高小鼠的体液免疫和细胞免疫水平,能强有力地抵抗强毒株CZ-1的攻击。结果表明,成功构建了日本乙型脑炎病毒PrMΔE基因与tPA信号肽序列融合基因DNA疫苗(pVAX-tPA-PrMΔE),为日本乙型脑炎病毒基因工程疫苗的进一步研究及应用奠定了基础。
2013年04期 v.43;No.428 351-357页 [查看摘要][在线阅读][下载 562K] [下载次数：229 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：3 ] - 蒋春英;魏建超;史子学;钟登科;邵东华;李蓓蓓;马志永;
为增强日本乙型脑炎病毒表位疫苗的免疫原性,提高其免疫效果,将日本乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白中编码的B细胞表位(150～156aa,307～316aa,327～333aa,386～399aa)及T细胞表位(60～68aa,436～445aa)序列连接于猪细小病毒(PPV)VP2的5′端,并插入到原核表达质粒pCold-Ⅰ中,构建成重组质粒pMEP-VP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),使重组蛋白MEP-VP2得到表达。Western-blot分析表明,表达产物能被抗JEV多抗和抗PPV多抗识别。电镜观察显示,表达的重组蛋白MEP-VP2能够在体外自我组装成病毒样颗粒PPV-VLP(JEV)。结果表明,N端连接JEV的多表位肽的猪细小病毒的VP2蛋白能体外组装成有活性的病毒样颗粒。
2013年04期 v.43;No.428 358-363页 [查看摘要][在线阅读][下载 514K] [下载次数：275 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：3 ] - 梁欠欠;侯绍华;李秀岭;贾红;袁维峰;鑫婷;孙建涛;朱鸿飞;
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)FZ06A株全长cDNA为模板,扩增并修饰GP3、GP5、M蛋白的基因,同时融合牛疱疹病毒VP22基因,构建了基于甲病毒复制子的PRRSV DNA疫苗pSCA-VPm3、pSCA-VPm5、pSCA-VP6和pSCA-V56。将其分别转染BHK-21细胞,通过检测转染细胞中目的基因的mRNA水平、目的蛋白的表达水平和转染细胞的凋亡情况,对该疫苗的体外表达特性进行初步研究。结果显示,PCR扩增得到长度分别为765、603、525bp的GP3、GP5、M蛋白的基因。经置换、敲除、融合VP22基因等修饰后获得长度分别为1 545、1 386、1 320bp的修饰后基因。疫苗转染细胞后,用RT-PCR能检测到目的蛋白的mRNA。IFA和Western-blot结果显示,转染细胞中均有目的蛋白表达,转染48h后细胞发生核固缩,甚至核裂解现象。证实,成功构建了基于甲病毒复制子的疫苗pSCA-VPm3、pSCA-VPm5、pSCA-VP6和pSCA-V56,在转染的BHK-21细胞中能实现目的蛋白的表达,且能诱导转染细胞发生凋亡。
2013年04期 v.43;No.428 364-371页 [查看摘要][在线阅读][下载 1053K] [下载次数：156 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：3 ] - 郑敏;李春艳;韦显凯;梁晟;苏娇秀;郑列丰;李军;
通过敲除与山羊痘病毒(GTPV)毒力相关的serpin基因以构建安全性更好的基因工程减毒株和病毒表达载体。采用PCR方法克隆了包含GTPV AV41株serpin基因(ORF149)及其侧翼长为1 745bp的片段,并在serpin基因片段内部分别插入报道基因EGFP和抗性基因gpt表达盒,构建GTPV重组转移载体pSp-Eg。然后将重组转移载体pSp-Eg与GTPV AV41株共转染BHK-21细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,并鉴定其遗传稳定性和生长特性。结果,成功获得一株敲除serpin基因的重组病毒vSp-Eg。该重组病毒在至少10代能稳定表达绿色荧光蛋白,在培养细胞中的生长特性与亲本毒株基本一致,但病毒效价降低1个数量级。结果表明,serpin基因是GTPV的复制非必需基因。
2013年04期 v.43;No.428 372-376页 [查看摘要][在线阅读][下载 649K] [下载次数：145 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：3 ] - 马玲;李广兴;洪琴;任玉东;任晓峰;
利用RT-PCR和SOE PCR技术扩增得到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HH08株NSP2全长基因,经抗原性和亲水性分析,将NSP2部分序列成功亚克隆于pET-30a(+)和PVAX1载体中。将阳性重组质粒pET30a-NSP2转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,经诱导表达获得107ku的重组NSP2蛋白。Western-blot检测表明,重组蛋白能够与PRRSV参考阳性血清反应。以纯化的重组NSP2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,其ELISA效价达到1∶1015以上;Western-blot试验表明,其具有良好的反应性和特异性。间接免疫荧光试验显示,用抗NSP2多克隆抗体可以检测到PVAX-NSP2转染BHK-21细胞所表达的NSP2蛋白,且与经典型和高致病型PRRSV毒株均有很好的特异性反应。病毒感染抑制试验表明,多抗血清对PRRSV经典和高致病性毒株的抑制率可达到68%和53%。上述研究结果为PRRSV检测及NSP2蛋白功能的深入研究奠定了基础。
2013年04期 v.43;No.428 377-383页 [查看摘要][在线阅读][下载 829K] [下载次数：223 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：3 ] - 赵高伟;段凤娟;任玉东;佟玲;王婧婧;曹丽艳;任晓峰;
为获得一株猪轮状病毒弱毒疫苗的候选株,用恒河猴肾细胞(MA-104)培养之前分离的猪轮状病毒DN30209株(PRV DN30209),并对预处理病毒的胰酶的浓度及时间、维持液(DMEM)中胰酶浓度和时间等条件进行优化,在最佳培养条件下对病毒进行连续传代,检测各代次病毒的TCID50,达到最高且稳定时,用该代次的病毒免疫PRV阴性BALB/c小鼠,于免疫后不同时间检测血清特异性中和抗体效价。结果,经20μg/mL胰酶37℃孵育40min,吸附90min,在含2μg/mL胰酶的DMEM中,病毒能在MA-104稳定增殖。经60代培养病毒TCID50由最初的103.40/mL增至106.00/mL,传至第60～63代时病毒TCID50维持在106.00/mL左右,并趋于稳定。选第60代病毒免疫小鼠,2周后小鼠血清中和效价为1∶91,4周后达到1∶128。结果表明,PRV DN30209株通过传代驯化培养可以作为弱毒疫苗候选株。
2013年04期 v.43;No.428 384-389页 [查看摘要][在线阅读][下载 687K] [下载次数：263 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：3 ] - 原冬伟;刘家森;郭东春;姜骞;林欢;司昌德;曲连东;
根据GenBank中的中国兔出血症病毒(RHDV)分离株VP60基因保守序列设计合成了内、外2对引物,在Bst DNA聚合酶的作用下完成等温核酸扩增反应,对反应条件逐一优化,并对临床样品进行检测。结果表明,该方法简便、快速、特异性好,灵敏性较常规反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)高100倍。该方法可同时扩增7株RHDV中国分离株,说明其对检测国内RHDV分离株的有效性。对15份临床样品的检测结果显示,环介导等温扩增(LAMP)阳性检出率达80%,RT-PCR检测阳性率为60%。该LAMP方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速、不需要复杂仪器设备、便于肉眼观察等优点,可作为临床检测RHDV的新方法,适合国内基层和实验室对RHDV的快速检测,具有广泛的推广应用价值。
2013年04期 v.43;No.428 390-395页 [查看摘要][在线阅读][下载 983K] [下载次数：158 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：3 ] - 徐玉;王晓玲;毕可东;
为了进行猪伪狂犬病病毒的早期诊断,根据gE基因的保守序列设计了1对引物,构建阳性重组质粒,建立TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,对Bartha-K61弱毒疫苗株(gE-株)及其他病毒不发生交叉反应;敏感性高,最低检测下限为10copies/μL,比常规PCR高100倍;重复性好,批内、批间重复试验的变异系数均小于2%。应用建立的方法与常规PCR分别对153份临床样品进行检测,检出率分别为67%、60%,二者的符合率是93.7%。结果表明,该检测方法可为伪狂犬病病毒的早期诊断提供技术手段。
2013年04期 v.43;No.428 396-400页 [查看摘要][在线阅读][下载 667K] [下载次数：158 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：4 ] - 朱永梅;曹永生;李鑫;马波;张文龙;高明春;王君伟;
为在毕赤酵母表达系统中表达无冗余氨基酸且具有抗病毒活性的鹅干扰素-α(IFN-α)蛋白,采用融合PCR法扩增获得鹅干扰素-α基因片段,将此片段连入pPICZαA载体,构建重组表达质粒pPICZαA-GoIFN-α,电击转化毕赤酵母感受态细胞X33,挑取阳性重组菌用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行West-ern-blot和ELISA分析,并测定重组IFN-α的生物活性。结果显示,融合基因获得高效表达,表达的蛋白以可溶形式存在,且相对分子质量较理论值稍大。经GEF-GPMV系统检测,证实表达的蛋白具有生物学活性,约为6.55×105 U/mL,比活力为1.80×105 U/mg。结果表明,利用毕赤酵母表达系统规模化生产具有生物学活性的鹅IFN-α有广阔的应用前景。
2013年04期 v.43;No.428 401-406页 [查看摘要][在线阅读][下载 947K] [下载次数：266 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：3 ] - 关玮琨;何丽丽;冯瑜菲;朱颖;刘文鑫;江馗语;胡文霞;师东方;
根据GenBank中犬细小病毒(CPV)VP2基因序列,利用Primer Explorer V4软件设计并合成了针对CPV VP2基因序列保守区域的4条寡核苷酸片段(F3/B3,FIP/BIP)作为LAMP引物。以CPV DNA为模板,通过对LAMP反应温度和时间的优化以及特异性试验、敏感性试验和对临床样品的检测,建立了一种针对CPV VP2基因的LAMP快速检测方法。结果显示,该LAMP检测方法只对CPV有梯状扩增条带,对犬瘟热病毒(CDV)、狂犬病病毒(RV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV-Ⅱ)无扩增条带;对CPV的最低检出量为2.1×10-2 TCID50,其敏感性约为常规PCR检测方法(最低检出量为2.1TCID50)的100倍,是犬细小病毒抗原快速检测试纸(最低检出量为101.5 TCID50)的1 500倍。临床样品的LAMP检测结果与PCR检测结果的符合率为100%。
2013年04期 v.43;No.428 407-411页 [查看摘要][在线阅读][下载 742K] [下载次数：288 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：3 ] - 王轶男;钱年超;黄国明;胡诗悦;薛书江;贾立军;张守发;
根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫内转录间隔子基因(ITS基因)和牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列,设计合成了2对特异性引物。通过对反应条件进行优化,建立了同时检测牛瑟氏泰勒虫和牛卵形巴贝斯虫的多重PCR方法。结果显示,用该多重PCR方法可同时扩增出2条与试验设计相符的1 020bp(牛瑟氏泰勒虫)和537bp(牛卵形巴贝斯虫)的特异性条带,对牛瑟氏泰勒虫和牛卵形巴贝斯虫的最低检出限分别为10pg/μL和1pg/μL。用该方法对采自吉林省珲春市的23份临床样本进行检测,结果牛瑟氏泰勒虫的阳性率为69%,牛卵形巴贝斯虫的阳性率为52%,混合感染率为52%。表明,建立的多重PCR方法可用于临床诊断。
2013年04期 v.43;No.428 412-415页 [查看摘要][在线阅读][下载 676K] [下载次数：163 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：3 ] - 郭小琴;包世俊;谭磊;何随彬;张凡庆;仇旭升;宋翠萍;丁铲;
参照GenBank中滑液支原体P53株序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增获得滑液支原体WVU1853菌株烯醇化酶基因并将其克隆至pGEM-T Easy,测序并完成点突变后构建重组表达质粒pET-28a-eno,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后纯化表达产物并测定其酶促活性。结果显示,表达产物具有水解酶活性,最适pH为7.5,最适温度为50℃,Mg2+可作为酶活性辅因子,相同浓度的Zn2+可提高酶活性,而Mn3+、Al 2+、Ni 2+、Ba2+和Li+对酶活性均有不同程度的抑制作用;其米氏常数(km)和最大反应速率(Vmax)分别为1.1×10-3 mol/L和0.739μmol/(L.min)。
2013年04期 v.43;No.428 416-420页 [查看摘要][在线阅读][下载 786K] [下载次数：267 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：3 ] - 王晓亮;朱灿灿;俞彬燕;韩婷;李广超;闫振龙;刘英;
为了获得完整的动物肺脏支气管动脉铸型标本,经过反复试验研究,建立了通过主动脉插管灌注制作滩羊支气管动脉铸型的方法。该方法的要点是,选择健康成年滩羊,取出新鲜心、肺及胸主动脉;利用自制三联式灌注器由胸主动脉插管;梯度灌注不同浓度ABS铸型剂;在水中硬化,密封静态腐蚀;手控强压水流冲洗。采用这种灌注法成功率高,获得了完整的支气管动脉铸型标本。标本主干充盈饱满,细小分支精细美观,立体感强,并能逐级显示支气管动脉血管之间的毗邻关系。
2013年04期 v.43;No.428 421-424页 [查看摘要][在线阅读][下载 779K] [下载次数：83 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：3 ] - 周建胜;陈慧;方梅;贾宁;余四九;
为了探讨沙冬青种子总黄酮抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的作用机制,以细胞存活率和抑制率为指标,采用MTT比色法进行了沙冬青种子总黄酮抗BVDV活性的研究。分别采用感染病毒同时给药、给药后接种病毒、先感染病毒后给药三种方式,观察沙冬青种子总黄酮的抗BVDV活性。结果显示,抗BVDV作用具有很好的量效关系,沙冬青种子总黄酮在体外随药物质量浓度的增加,细胞存活率和病毒抑制率明显升高,病毒的TCID50为10-5.29/0.1mL;药物质量浓度在小于0.188mg/mL范围内同时给药途径的细胞保护率和病毒抑制率明显高于其余2种给药途径。结果表明,沙冬青种子总黄酮在体外有良好的抗BVDV活性的作用。
2013年04期 v.43;No.428 425-429页 [查看摘要][在线阅读][下载 616K] [下载次数：308 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：20 ] |[阅读次数：3 ] - 朱春生;赵建军;闫喜军;王伟;
以T7RNA聚合酶或RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ为基础的病毒反向遗传操作系统在设计构建和应用上由繁到简不断改进。本文分别以新城疫病毒、狂犬病病毒和禽流感病毒等负链RNA病毒为例,综述了近十年来病毒反向遗传操作中的构建策略创新及其在分子病毒学和反向疫苗学的应用,旨在为更好地利用该技术提供参考。
2013年04期 v.43;No.428 430-435页 [查看摘要][在线阅读][下载 702K] [下载次数：734 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：3 ] - 陈亚冰;兰道亮;汤承;李键;
为了加深对NLRC5分子结构与功能复杂性的理解,论述了NLRC5的分子结构、组织差异表达与定位、生物学功能。重点论述了NLRC5在抗病毒免疫过程、炎症小体形成以及MHCⅠ分子基因转录调节过程中的功能,以期为NLRC5与天然免疫的相关研究提供参考。
2013年04期 v.43;No.428 436-440页 [查看摘要][在线阅读][下载 688K] [下载次数：503 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：3 ] 下载本期数据