2026年 03期
弓形虫含MFS结构域蛋白TGME49＿226020的基本生物学功能研究
马志雅;李婷婷;李文硕;王萌;朱兴全;张念章;为探究弓形虫含主要协同转运蛋白超家族（MFS）结构域蛋白TGME49＿226020的基本生物学功能，利用CRISPR-Cas9技术结合生长素诱导的降解系统（m AID）分别构建弓形虫RH-TIR1和Pru-TIR1野生株的条件性缺失虫株RH-TIR1-TGME49＿226020-m AID和Pru-TIR1-TGME49＿226020-m AID。间接免疫荧光试验结果显示，TGME49＿226020蛋白定位于细胞质，加入吲哚乙酸（IAA）后目的蛋白被成功降解。将IAA加入RH-TIR1-TGME49＿226020-m AID虫株的培养基中，与RH-TIR1野生株相比，条件性缺失虫株感染宿主细胞后噬斑减小（P<0.000 1）、入侵能力减弱（P<0.001）、细胞内复制能力减弱（P<0.001），但对逸出能力和弓形虫体内各细胞器的稳定性无影响。缓殖子转化试验结果显示，加入IAA降解后，RH-TIR1-TGME49＿226020-m AID虫株和Pru-TIR1-TGME49＿226020-m AID虫株的转化能力与相应野生株相比均显著减弱（P<0.001）。结论：TGME49＿226020为含MFS结构域的转运蛋白，降解后可影响弓形虫体外细胞内的正常生命活动，具体作用机制需进一步探究。
干扰素诱导跨膜蛋白1促进猪丁型冠状病毒复制作用研究
卢春雨;牛自艺;徐双媛;李彬;李基棕;旨在探究干扰素诱导跨膜蛋白1(IFITM1)在猪丁型冠状病毒（PDCoV）复制中的作用。将PDCoV感染仔猪空肠上皮细胞（IPEC-J2），采用qPCR和Western-blot分别检测IFITM1的转录和蛋白表达水平；利用siRNA沉默IFITM1后观察其对病毒复制的影响，并进一步分析IFITM1在病毒复制周期中的具体作用；通过转染PDCoV不同结构蛋白筛选调控IFITM1表达的关键蛋白，并结合免疫荧光技术分析IFITM1的亚细胞定位特征。结果显示，PDCoV感染显著上调IPEC-J2细胞中IFITM1的表达。siRNA沉默IFITM1可抑制PDCoV复制，且IFITM1主要促进病毒内化和早期复制。进一步研究发现，PDCoV S蛋白是诱导IFITM1上调的关键因子，免疫荧光显示二者在细胞质和细胞膜上共定位。综上所述，IFITM1能显著促进PDCoV复制，为PDCoV致病机制研究提供了新的理论依据。
非洲猪瘟病毒p30、p54和p72蛋白多表位抗原的制备及其免疫原性评价
杨锐;茹毅;蒋成辉;常艳燕;郝荣增;张越;杭洁;旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)多表位抗原并评价其在疫苗中的应用。本研究设计了分子伴侣(TF16)与ASFV多表位抗原原核重组质粒，可溶性表达了非洲猪瘟病毒多表位重组蛋白(ASFV-pBT)，重组蛋白纯化、鉴定后免疫小鼠并进行免疫原性评价，为非洲猪瘟亚单位疫苗研究提供试验基础。结果表明，ASFV-pBT可在大肠杆菌中可溶性表达，并被ASFV抗体阳性血清特异性识别。免疫小鼠血清中抗体效价可达1∶32 000，且ASFV-pBT可有效激活小鼠T淋巴细胞的增殖，CD4+和CD8~+T淋巴细胞较阴性对照组显著提升(P<0.001),IFN-γ和IL-4细胞因子的表达也显著高于阴性对照组(P<0.001)。通过体内、体外双重验证表明ASFV-p BT重组蛋白展现出良好的免疫原性，能够有效诱导机体产生显著的体液免疫和细胞免疫，为ASFV表位疫苗的研发提供了参考。
H1N2亚型猪流感病毒的灭活稳定性及小鼠免疫原性评价
林梦琪;张楠;全柯吉;李之璠;路子俊;杨辉;秦涛;陈素娟;彭大新;旨在提高猪流感病毒（SIV）的灭活稳定性和免疫原性。将H1N2亚型SIV A/Swine/Jiangsu/1281/2019(JS1281)的HA和NA基因与A/Puerto Rico/8/1934(PR8)病毒的6个内部基因构建重组病毒r1281，并对r1281 HA蛋白上与热稳定性相关的氨基酸位点进行定点突变（K170Q、S174T、D202I、S174T+Y175F），测定r1281及突变重组病毒的生物学特性；通过小鼠免疫攻毒试验评价突变重组病毒r1281-174T+175F的保护效果。结果显示，与母本病毒r1281相比，突变重组病毒r1281-174T+175F在MDCK细胞上的复制能力有所提高，对甲醛或二乙烯亚胺（BEI）的灭活稳定性显著提升；甲醛或BEI灭活后r1281-174T+175F免疫组能诱导机体产生更高水平的血凝抑制抗体，同时可以保护小鼠脏器免受病理损伤。因此，S174T和Y175F联合突变是保持SIV灭活稳定性的关键位点，且不改变重组病毒的免疫原性，为提高猪流感灭活疫苗的抗原稳定性提供了数据支撑。
猫杯状病毒VP1及其截短体VP1-CDE重组蛋白的表达纯化与免疫效果评价
朱新龙;王红梅;刘怡涵;赵珍萍;靳亚丽;魏衍全;构建并表达猫杯状病毒(FCV)VP1及其截短体VP1-CDE，并评价其免疫原性。将目标基因克隆至pET28a-SUMO载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导尝试可溶性表达。SDS-PAGE结果显示，VP1蛋白与VP1-CDE蛋白分子质量分别约为60 k Da与15 k Da，与理论值相符；用6×His标签抗体进行Western-blot试验证实其正确性。重组蛋白经Ni2+亲和层析纯化后，与弗氏佐剂等体积乳化后免疫BALB/c小鼠，采集血清进行间接ELISA，结果显示，VP1与VP1-CDE组均能诱导高滴度针对相应蛋白的特异性Ig G；在前3次免疫时，抗体水平随免疫次数增加而升高，第4次免疫后第14天测得抗体水平和第3次免疫后第14天的水平无显著差异，抗体水平达到平台期。病毒中和试验结果表明，三免后第14天VP1-CDE组中和抗体滴度达1∶223,VP1组为1∶178，二者水平相当。综上所述，VP1-CDE以较小分子质量实现与全长VP1相当的免疫原性，且表达中更易实现正确折叠、不易形成包涵体，可作为FCV亚单位疫苗的优选抗原，为后续疫苗研发提供了试验依据。
小鼠细小病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立
陈莉;张旭亮;刘彪;吴伟;马畅;赵迎峰;制备小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白单克隆抗体，建立一种基于双抗体夹心ELISA的实验动物小鼠MVM抗原检测方法。应用原核表达质粒表达VP2蛋白，纯化蛋白免疫雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体，以获得的单抗1C5作为捕获抗体，HRP标记的单抗8B9作为检测抗体，优化条件建立双抗体夹心ELISA检测方法，并对其灵敏性、特异性和重复性进行系统评价并与qPCR检测进行比对分析。结果显示，表达纯化了MVM VP2蛋白，免疫雌性BALB/c小鼠，免疫程序结束后筛选获得2株单克隆抗体，命名为1C5和8B9,Western-blot和间接免疫荧光鉴定发现这2株抗体可与MVM病毒和重组蛋白特异性结合。以1C5作为捕获抗体，HRP标记的8B9作为检测抗体建立了双抗体夹心ELISA方法，其对MVM病毒和重组蛋白最低检测限分别为103.4TCID50/m L和50 ng/m L；与4种常见病毒感染的小鼠血清均无交叉反应，包被ELISA板条的批间变异系数均小于10%，与qPCR检测结果相比总符合率为100%。结果表明，成功制备了2株MVM单克隆抗体，应用这2株抗体建立的MVM双抗体夹心ELISA方法具有较好的灵敏性和特异性，与qPCR检测法相比一致性较好，为实验动物小鼠的临床诊断、高通量筛查监测提供了有效的检测方法，从而保障实验动物的SPF状态，为生命科学研究提供健康可靠的实验动物。
牛结节性皮肤病病毒A33R蛋白的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
包燕玲;宋昱庆;户鑫兵;钟匀汝;田占成;苟惠天;关贵全;殷宏;独军政;为了建立一种快速准确的牛结节性皮肤病病毒(LSDV) ELISA抗体检测方法，本研究参考GenBank中的LSDV A33R基因序列，设计截去编码跨膜区片段，密码子优化后合成该截短基因并克隆至原核表达质粒pET-28a，构建了重组质粒pET-28a-A33RΔ45-67 aa,IPTG诱导表达A33RΔ45-67 aa蛋白，纯化后以其作为诊断抗原建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示，利用大肠杆菌成功表达并纯化获得分子质量为21 k Da的重组A33RΔ45-67aa蛋白，并建立了LSDV间接ELISA抗体检测方法，该方法具有良好的特异性和敏感性。批间和批内重复试验变异系数均低于10%，表明该间接ELISA方法重复性良好，稳定性高。该方法与IDScreen Capripox双抗原夹心ELISA试剂盒检测结果总符合率为97.7%，表明其可用于LSDV的抗体检测，将为LSD的防控提供技术支撑。
基于RPA-CRISPR/Cas12b的一管式H5亚型禽流感病毒快速检测方法的建立
孔玉方;王慧煜;许晓琳;袁向芬;吴绍强;针对H5亚型禽流感病毒相对保守的3个区域，分别设计了sgRNA和逆转录重组酶聚合酶恒温快速检测技术（RT-RPA）的特异性扩增引物，建立了基于RPA-CRISPR/Cas12b检测H5亚型禽流感病毒的方法，并对该检测方法的敏感性、特异性、重复性和可行性进行验证。结果显示，重组质粒阳性标准品检测的灵敏度达到了1.0 copies/μL，是荧光RT-PCR灵敏度的10倍；该方法与H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒（NDV）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的核酸均无交叉反应；用该方法检测50份临床模拟样品并与国标推荐的实时荧光RT-PCR进行比较，结果两种检测方法符合率达100%。上述结果表明，本研究建立的H5亚型禽流感病毒RPA-CRISPR/Cas12b检测方法可为口岸基层的快速筛检工作提供技术支撑。
基因Ⅰ型非洲猪瘟病毒（SD/DY-Ⅰ/21株）阳性血清定性标准样品的研制
史莉圆;朱远茂;张媛;张晶晶;周梦棋;穆颖;姜怀玉;叶家美;倪建强;顾小雪;王传彬;李琦;孙恩成;赵东明;刘玉良;金山;以灭活的基因Ⅰ型非洲猪瘟病毒（ASFV）(SD/DY-Ⅰ/21株)为免疫原，免疫SPF猪制备阳性血清，成功研制了基因Ⅰ型ASFV(SD/DY-Ⅰ/21株)阳性血清定性标准样品500瓶。依据《非洲猪瘟诊断技术》（GB/T 18648—2020）推荐的间接ELISA方法，对标准样品进行均匀性检验、稳定性监测和评估，并经9家实验室进行协作定值。结果表明：所研制的标准样品纯净，特异性、均匀性和稳定性均良好，无生物传染风险；标准样品在-20℃环境下可稳定保存至少12月，在4、25、37℃环境下均可稳定保存至少7 d；协作定值结果显示，9家实验室所检测的标准样品均为基因Ⅰ型ASFV抗体阳性。本研究为基因Ⅰ型ASFV血清学检测质量控制、检测能力比对验证，以及检测试剂（盒）、人员、检测方法等测评工作提供了标准样品实物，为我国非洲猪瘟防控提供了技术和产品支撑。
非洲猪瘟病毒B169L蛋白多克隆抗体制备
武正前;周万卉;黄秀梅;邓宠贤;张旭辉;朱向涛;李丹;杨文萍;郑海学;B169L是非洲猪瘟病毒（ASFV）编码的一种膜蛋白，其具体生物学功能尚不明确。为探究其作用机制，本研究制备了B169L多克隆抗体。首先，通过在线生物信息学工具预测，B169L蛋白包含两段跨膜区和一个信号肽，提示其可能定位于内质网。随后，利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化去除跨膜区的B169L蛋白，以此免疫家兔获得多克隆抗体。免疫印迹结果表明，该抗体可特异性识别ASFV感染细胞中表达的B169L蛋白。上述结果表明，本研究成功制备了特异性的B169L多克隆抗体，为解析ASFV膜蛋白B169L的结构与功能奠定了基础。