2026年 05期
利用猪源单B细胞中和抗体解析A型口蹄疫病毒AF72疫苗毒株抗原位点4的关键氨基酸
杨佳欣;李凤娟;黄书伦;李平花;朱晓沛;张贺贺;李娇阳;曹轶梅;包慧芳;孙普;付元芳;李坤;卢曾军;利用猪源单B细胞中和抗体，解析A型口蹄疫病毒（FMDV）AF72疫苗毒株的抗原结构特征。从猪源单B细胞抗体库中筛选12对天然配对的重链与轻链序列并构建抗体表达质粒，转染HEK-293F细胞进行表达。通过间接ELISA、间接免疫荧光试验和病毒中和试验验证抗体反应性和中和活性，筛选中和抗体逃逸突变株，反向遗传拯救单点突变毒株验证抗原表位的关键氨基酸位点。结果显示，12株抗体中有11株为A型FMDV特异性抗体，其中6株为AF72特异性中和抗体。PAF26、PAF27、PAF31和PAF32株的关键识别位点均为VP3 A68;PAF42株的关键识别位点为VP3 G70;PAF44株的关键识别位点为VP3 E139，这些残基在病毒衣壳表面的空间位置相邻。本研究鉴定了AF72疫苗毒株抗原位点4的关键氨基酸，为A型FMDV疫苗改造设计提供了支撑。
表达O型口蹄疫病毒中和抗体转基因细胞系的构建与应用
杨彪;齐晓兰;吴国华;晏子龙;郝荣增;郑东东;谢正杰;刘宝;闫祯芳;冯涛;包世俊;郑海学;探究体外构建的、可表达口蹄疫病毒(FMDV)中和抗体的细胞系，是否能够发挥抑制该病毒感染与复制的作用。首先，构建以单链抗体(scFv)形式表达FMDV中和抗体的载体质粒。为了进一步提高中和抗体分泌到胞外的效率，在该表达载体中分别插入了4种分泌型信号肽的表达序列。通过脂质体转染法将各个表达载体转入BHK-21细胞，经嘌呤霉素抗性筛选，成功构建了相应的稳定转基因细胞系。借助Western-blot、TCID50等试验方法，对FMDV在各转基因细胞系的复制水平进行了系统检测与评估。结果显示，携带mIgκ信号肽的细胞系对BHK-21细胞内FMDV的复制具有显著抑制效果，且病毒感染所导致的细胞病变程度明显减轻。这些结果表明，在体外培养的细胞中转入scFv形式的中和抗体，可以显著抑制FMDV的复制，为家畜疫病的防控提供了新思路。
猪流行性腹泻病毒Nsp9突变毒株的构建及生物学特性分析
庄科勤;翁梁;王佳宁;范宝超;李彬;孙敏;猪流行性腹泻病毒（PEDV）非结构蛋白Nsp9在病毒复制中具有重要功能，其保守的第59位半胱氨酸参与蛋白在体外溶液中的二聚化及RNA结合。本研究旨在通过构建Nsp9第59位半胱氨酸突变为丙氨酸的重组病毒，探究该位点对PEDV复制能力的影响。利用CRISPR/Cas9介导的反向遗传学技术，以PEDV G2b型流行毒株为骨架，构建Nsp9第59位氨基酸突变的重组病毒。通过间接免疫荧光、Western-blot和病毒生长曲线测定，系统分析该重组病毒的感染性、蛋白表达及复制特性，评估该位点突变对PEDV复制能力的影响。成功获得重组病毒rAH2012/12-Nsp9-C59A，该重组病毒在Vero细胞中可稳定传代，并有效诱导PEDV N蛋白的表达。生长动力学显示，该重组突变株的早期复制趋势与亲本株基本一致，在感染后期病毒滴度高于亲本毒株。本研究揭示了PEDV Nsp9第59位半胱氨酸突变对病毒在Vero细胞中复制的影响，为深入理解PEDV Nsp9的功能提供了新线索。
共表达鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因和鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建与鉴定
周小汇;刘丹;薛麒;孔冬妮;吕岱玥;印春生;毛娅卿;湛洋;为了构建共表达鸡传染性贫血病毒（CIAV）VP1、VP2基因和鸡γ干扰素（ChIFN-γ）的重组鸡痘病毒转移载体，采用同源重组技术，将CIAV的VP1、VP2基因和ChIFN-γ基因以及报告基因lacZ整合至鸡痘病毒（FPV）S-FPV-017株基因组的复制非必需区。其中，VP1、VP2与ChIFN-γ基因由FPV早晚期启动子LP2EP2驱动表达，而lacZ报告基因则在FPV晚期启动子P11调控下进行表达，构建重组转移载体pSY681-VP1-VP2-ChIFN-γ。将该重组质粒转染至已感染亲本FPV S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞（CEF）中，使其与FPV基因组发生同源重组。经过连续8轮筛选与纯化，获得能够稳定表达CIAV VP1、VP2和ChIFN-γ及lacZ报告基因的重组鸡痘病毒，命名为rFPV-VP1-VP2-ChIFN-γ。PCR检测结果显示，rFPV-VP1-VP2-ChIFN-γ基因组中成功整合了CIAV的VP1、VP2及ChIFN-γ基因。间接免疫荧光试验与蛋白免疫印迹分析进一步证实，上述外源蛋白在rFPV-VP1-VP2-ChIFN-γ感染的CEF细胞中均获得有效表达。本研究结果表明，FPV基因组的复制非必需区能够容纳并驱动多个禽类病原相关外源基因表达，为开发多价重组基因工程疫苗奠定了重要基础。
犬细小病毒mRNA疫苗的制备及免疫原性评价
高璐瑶;赵玉莹;罗永文;夏天;针对犬细小病毒（CPV）主要保护性抗原VP2蛋白，设计并制备mRNA候选疫苗，系统评价其体外表达特性及在小鼠体内的免疫原性。从NCBI数据库获取VP2基因标准序列，分别设计分泌型VP2(sVP2)和膜表达型VP2(mVP2)，并构建相应的mRNA疫苗载体；经载体线性化、体外转录、纯化及加帽处理获得功能性mRNA。随后制备脂质纳米颗粒包封的mRNA疫苗，并按照免疫程序对小鼠进行免疫原性评价。结果显示，成功构建2种针对CPV的mRNA疫苗，其可在细胞中有效表达VP2抗原，其中sVP2可诱导小鼠体液免疫应答和中和抗体的产生，为犬细小病毒mRNA疫苗的开发策略提供了实验依据和理论支持。
马链球菌马亚种MDMC-0316株主要毒力蛋白Eq5和IdeE2的免疫原性研究
韩博栋;梁建忠;朝木丽格;欧云文;白文成;王雪;李旭阳;刘芳;格日勒图;为探索马链球菌马亚种(SEE)MDMC-0316株Eq5和IdeE2蛋白作为亚单位疫苗靶标的可能性，PCR扩增eq5和ideE2基因并测序，对其相应氨基酸序列进行模拟免疫应答分析；随后将其克隆至pET-28a载体中进行表达纯化，利用纯化蛋白免疫小鼠，采用ELISA方法测定免疫抗体效价和细胞因子水平。模拟分析显示，Eq5和IdeE2蛋白具有良好的免疫原性，对IL-2和IFN-γ刺激产生效果佳；两种蛋白免疫小鼠后均产生了较高水平的Ig G,Eq5和IdeE2蛋白免疫血清抗体在效价为1∶51 200时D450 nm值均大于1.0;Eq5蛋白免疫组IL-2、IL-4和IFN-γ分别为61.8、105.8和151.3 pg/mL,IdeE2蛋白免疫组IL-2、IL-4和IFN-γ分别为89.1、98.0和173.5 pg/mL，二者相比，IdeE2可显著刺激IL-2和IFN-γ产生，与免疫应答模拟结果基本一致。本试验为SEE新型亚单位疫苗研究提供了候选抗原。
鸡毒支原体重组酶介导等温扩增-琼脂糖凝胶电泳检测方法的建立
王舒;郭菲;王芳;牛春晖;刘良波;崔耀成;轩慧勇;建立一种简便、快速、可视化的鸡毒支原体(MG)重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。按照RAA引物设计原则，分别针对MG mgc2基因和MG pvpA基因的保守区设计引物，制备标准重组质粒，筛选引物后，进一步优化RAA-琼脂糖凝胶电泳法引物浓度、反应温度和反应时间，并分析该方法的特异性、敏感性及重复性。为进一步验证其临床适用性，采用RAA、聚合酶链反应(PCR)及实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)3种方法，对100份疑似MG感染的临床样本进行平行检测。结果表明：在30℃等温条件下，针对目标基因的RAA扩增反应可在15 min完成；扩增产物经30 min琼脂糖凝胶电泳后，通过紫外分析仪可直接观察到清晰的特异性条带。方法学验证显示，该RAA检测体系与其他常见病原无交叉反应，最低检出限达6.5×101 copies/μL，表明该方法特异性强、灵敏度高且重复性良好。适用性试验结果显示，RAA与PCR的检测符合率为96%，与RFQ-PCR的检测符合率为98%。综上所述，本研究中建立的RAA-琼脂糖凝胶电泳法操作简便、特异性强且灵敏度高。该方法适用于配备基础实验室的基层机构开展MG感染的诊断工作，具有良好的应用前景。
基于N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体的阻断ELISA方法的建立
杨倩倩;赵鑫宇;郭婷;林梦琪;印云聪;杨辉;缪鑫煜;秦涛;彭大新;陈素娟;为建立一种准确、灵敏的检测N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)抗体的ELISA方法，本研究利用IEDB网站的分析预测工具对N8亚型AIV神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白抗原表位进行预测，将表位相对集中的一段基因片段克隆至pET系列表达载体，利用原核表达系统表达目的蛋白(命名为NA8蛋白)，将纯化复性的NA8重组蛋白免疫BALB/c小鼠，通过ELISA和IFA技术联合筛选阳性杂交瘤细胞。获得1株能稳定分泌抗NA8蛋白的Ig M型单克隆抗体(mAb) N8/17。经ELISA、IFA和Western-blot检测，该m Ab特异性和广谱性良好，IC50为4.96μmol/L。以N8/17作为阻断mAb，对ELISA方法的各项反应条件进行优化，建立了检测AIVN8亚型抗体的阻断ELISA方法。当抗原包被浓度为5μg/m L，阻断mAb N8/17稀释度为1∶80，待检血清1∶1稀释，100 g/L FBS封闭120 min，底物作用10 min时阻断效果最佳。该方法具有较好的特异性和广谱性，批内和批间变异系数均小于10%。临床模拟样本检测结果显示，阳性样品检出率为100%。该方法特异性和广谱性较好，适用于N8亚型AIV感染的早期诊断，具有一定的临床应用潜力。
猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立与应用
王克雄;刘智;周涛;李彬;彭丹;王子建;江熙;万荣杰;夏伟;林艳;李三鹏;曹丽艳;李凯;为建立快速、特异且适用于临床的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）抗体检测方法，以重组TGEV核衣壳（N）蛋白为包被抗原，通过优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标抗体稀释度及孵育时间与温度等关键参数，构建阻断ELISA体系，并对其性能与临床应用价值进行评估。结果显示，该方法的最优反应条件如下：抗原包被质量浓度为1.0μg/m L；血清稀释度为1∶2,37℃孵育45 min；酶标抗体稀释度为1∶12 000,37℃孵育30 min；显色时间为10 min。特异性试验结果表明，该方法与猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪萨佩罗病毒等常见猪源病原的阳性血清均无交叉反应，特异性良好。可检出1∶32稀释的TGEV阳性血清，灵敏度与商品化试剂盒相当。批内与批间重复性试验的变异系数均小于10%，检测试剂在4℃保存12个月仍保持稳定。临床应用结果显示，用该方法对124份临床猪血清样本进行检测，与商品化TGEV抗体检测试剂盒的符合率达96.77%，κ值为0.93，表明二者检测结果高度一致。综上所述，建立的TGEVN蛋白阻断ELISA抗体检测方法具备良好的特异性、敏感性、重复性及稳定性，可用于TGEV流行病学调查及疫苗免疫效果评估，为猪传染性胃肠炎的科学防控提供了可靠技术支撑。
牛结节性皮肤病病毒ORF122蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
王天敏;温渊;李超;汤芳;戴建君;薛峰;旨在制备并鉴定牛结节性皮肤病病毒（LSDV） ORF122重组蛋白及其单克隆抗体。选取ORF122蛋白膜外功能区（AA68～196），构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达并纯化获得重组蛋白rLSDV122；以rLSDV122免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术筛选分泌抗LSDV ORF122抗体的杂交瘤细胞株，对所得单克隆抗体进行亚型鉴定和间接ELISA效价测定，并采用免疫印迹和间接免疫荧光试验评价其对感染细胞中天然ORF122的识别能力及与常见牛源传染性病原体的交叉反应性。结果显示，成功获得分子质量约17k Da的重组蛋白rLSDV122，以及2株IgG1/κ型单克隆抗体2D5和4H3，其间接ELISA终点效价分别为1∶128 000和1∶64 000。免疫学检测表明，2株单抗均能特异性识别LSDV感染的MDBK细胞中的天然ORF122蛋白，且与多种常见牛源传染性病原体无交叉反应。综上所述，成功制备了针对LSDV ORF122的特异性单克隆抗体，为LSDV病原学研究及相关免疫诊断技术开发奠定了基础。