网络首发
表达尼帕病毒F和G包膜糖蛋白的VSV假病毒的构建与优化
邝瑞欣;徐瑞娟;田雨菲;刘彦峰;赵飞杨;屈阳;廖瑛;仇旭升;谭磊;宋翠萍;丁铲;孙英杰;为在较低生物安全等级条件下安全、有效地研究尼帕病毒（NiV），本研究旨在构建一种携带报告基因、并能模拟NiV入侵过程的假病毒模型。采用已有的基于水疱性口炎病毒（VSV）的假病毒体系rVSV-ΔG-EGFP，该体系病毒基因组中以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）替代VSV的G糖蛋白基因。在细胞中通过外源方式表达NiV的F和G囊膜蛋白后，利用该体系包装假病毒并感染细胞，成功包装出重组假病毒rVSV-ΔG-NiV F/G-EGFP。通过透射电镜与Western-blot验证了假病毒颗粒包装成功及囊膜蛋白的正确表达。中和试验证实，该假病毒可被NiV特异性中和抗体有效抑制。本研究构建的假病毒系统为尼帕病毒的中和抗体评价、药物筛选及入侵机制研究提供了安全有效的技术平台。
冠状病毒检测方法研究进展
郑永辉;马志倩;李志伟;赵晓静;李咏琪;李洋;肖书奇;近年来，由冠状病毒引发的疫病频繁暴发与流行，给全球公共卫生和社会经济带来了严峻挑战。为有效遏制疫情蔓延，亟需建立快速、准确、高通量且易于操作的检测技术，以实现对阳性病例的早期筛查，并为精准防控策略实施提供科学依据。本文综述了现有冠状病毒检测方法的研究进展，系统阐述了各技术的原理、优势及局限性，并对未来新型检测技术的发展方向进行了展望。
鉴别布鲁菌感染与免疫的Bp26单克隆抗体阻断ELISA方法的建立与应用
马春慧;罗意;吕皓晴;牟雪梅;刘立元;郑福英;李永清;储岳峰;周沛;许健;为建立一种可鉴别布鲁菌疫苗免疫与野毒感染的血清学方法，基于布鲁菌外膜蛋白Bp26及其HRP标记的单克隆抗体（HRP-mAb），建立并优化了阻断ELISA。经系统优化，确定最佳反应条件为：Bp26包被量为250 ng/孔，0.1 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释，4 ℃包被12 h，30 g/L BSA封闭1 h，待检血清37 ℃孵育1 h，HRP-mAb（1︰2000）37 ℃孵育30 min，TMB显色15 min，以阻断率≥ 37.55%作为阳性判定标准。该方法与金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌O78、沙门菌、李斯特菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌阳性血清无交叉反应，批内与批间变异系数均低于10%，具有良好的特异性和重复性。使用195份临床血清验证，其与虎红平板凝集试验、商品化布鲁菌cELISA试剂盒及商品化Bp26-ELISA试剂盒的符合率分别为96.36%、98.79%和92.82%。结果表明，所建立的阻断ELISA方法性能稳定、结果可靠，可为布鲁菌疫苗免疫与野毒感染的鉴别诊断提供有效技术手段。
牛分枝杆菌融合蛋白ESAT-6/CFP-10/Rv3872抗体间接ELISA检测方法的建立与应用
王文浩;葛家振;宋国栋;刘一健;宋银娟;郑福英;李仁阁;陈胜利;李劼;储岳峰;旨在建立检测牛分枝杆菌(Mb)抗体的间接ELISA(iELISA)方法。选取Mb的ESAT6、CFP10与Rv3872基因，通过柔性接头(GGGS)4连接，克隆入pET-28a(+)载体，表达重组蛋白ESAT-6/CFP-10/Rv3872(E-C-R)，以该蛋白作为抗原建立iELISA抗体检测方法并评估其性能。结果显示，当抗原包被质量浓度为100 μg/mL、以10g/L甜菜碱溶液4℃封闭12h、血清1∶100稀释37℃孵育1h、HRP-绵羊抗牛IgG1∶10000稀释37℃孵育60min、底物显色15min时为最佳反应条件；该方法的临界值D450nm为0.39。经比较试验验证，该法的灵敏度高于商品化的iELISA试剂盒，且与常见细菌包括沙门菌、副结核分枝杆菌、牛支原体、布鲁菌及大肠杆菌阳性血清无交叉反应，批内批间差异的变异系数均小于10%，表现出良好的灵敏性、特异性与重复性。同时，该方法具有较高的稳定性，抗原包被板及各试剂在2～8℃条件下可稳定保存12个月以上。以建立的iELISA方法检测100份临床血清，与结核菌素皮试试验、商品化抗体试纸条及商品化iELISA试剂盒的总符合率分别达到87%(87/100)、86%(86/100)与93%(93/100)。本研究成功建立了一种高灵敏度、高特异性、良好重复性且稳定的Mb iELISA 抗体检测方法，为牛结核病的血清学诊断提供了新技术。
铁死亡相关基因GPX4在不同海拔牦牛组织中的表达特征研究
李天帅;郭靖岚;李忠铎;李争博;李妙然;王佳琳;李玲霞;李国秀;荆海霞;令小东;GPX4作为调控脂质过氧化和铁死亡的关键酶，在机体应对氧化应激损伤中发挥重要作用。为探究其在不同海拔牦牛组织中的表达特征，本研究采用首先RT-qPCR、Western-blot、免疫组化技术，检测不同海拔牦牛骨骼肌、心肌及肺脏组织中GPX4(mRNA)和GPX4（蛋白）的表达特征；其次，结合细胞低氧模型验证低氧对GPX4的调控作用；随后通过克隆牦牛GPX4基因，分析其序列特征。RT-qPCR、Western-blot定量结果显示，随着海拔升高，牦牛GPX4（mRNA）和GPX4（蛋白）在骨骼肌、心肌及肺脏组织中表达均显著下调（P＜0.05），相同海拔条件下，肺脏组织中GPX4的mRNA表达显著高于心肌和骨骼肌（P＜0.05）。免疫组织化学结果显示，GPX4主要定位于细胞核中且阳性细胞数目随海拔升高而降低。细胞低氧模型结果显示，低氧培养的牦牛骨骼肌细胞中，GPX4蛋白表达水平显著低于常氧条件（P＜0.05）。序列特征结果显示，牦牛GPX4基因CDS区全长594 bp，编码197个氨基酸，经序列比对发现，其与爪哇野牛亲缘性最近，且氨基酸序列在关键功能区域高度保守。综上，GPX4在牦牛组织中的表达呈现海拔依赖性下调，这可能与其对高原低氧的适应性有关。
O型FMDV病毒样颗粒真核细胞稳定表达系统的建立及应用
郭祥龙;黄园园;李雪彤;孙世琪;郭慧琛;吴金恩;牛家强;为实现口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白在哺乳动物细胞中的稳定表达，采用一种基于多基因共表达的策略，利用piggyBac(PB)转座子结合四环素诱导型表达质粒，将携带VP0、VP1和VP3基因的3个独立表达单元整合至BHK-21细胞染色体中。通过荧光蛋白标记及抗生素筛选，成功获得可诱导型表达FMDV结构蛋白的细胞系（BHK-21-VP013）。Western-blot、酶联免疫吸附法（ELISA）和透射电子显微镜分析结果显示，该细胞系能够高效表达FMDV衣壳蛋白，并具备病毒样颗粒（VLPs）的组装能力。小鼠免疫试验显示，所得VLPs可诱导产生高水平的特异性抗体，包括中和抗体。流式细胞术分析表明，所得VLPs成功激发了机体全面且均衡的T细胞免疫应答。综上所述，本研究成功构建了稳定表达FMDV衣壳蛋白的哺乳动物细胞系，并证实其产生的VLPs具备良好免疫原性，为推动哺乳动物细胞生产FMDV亚单位疫苗的研发提供了重要实验基础。
五种羊病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用
王素秋;万本屹;赵相鹏;张伟;白子龙;杜思乐;吴丹;张小寒;史喜菊;张灿;为建立一种可同步检测和鉴别蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、施马伦贝格病毒(SBV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、绵羊痘和山羊痘病毒(SPPV-GTPV)的方法，针对上述病毒的保守基因序列设计特异性引物和探针，通过对反应条件多次优化，建立了上述五种病毒的多重实时荧光RT-PCR(reverse transcription PCR)检测方法，并与相应的单重实时荧光RT-PCR方法进行比较。标准曲线分析显示，多重与单重方法的扩增效率(E值)均在90%～100%之间，相关系数(R2)均大于0.996，多重反应体系未产生明显的相互干扰或灵敏度降低现象。多重荧光RT-PCR检测方法对各靶标的最低检测限为5.31 copies/μL，特异性为100%。对6份BTV、4份PPRV和10份FMDV阳性样品检测的符合率为100%。对来自中国西北地区的500份临床样品进行检测，共检出PPRV阳性24份、FMDV阳性10份和BTV阳性1份，检测结果与单重检测方法完全一致。研究结果表明，本研究中建立的多重实时荧光RT-PCR方法可实现BTV、FMDV、SBV、PPRV和SPPV-GTPV的同步检测与鉴别，适用于临床上混合感染的快速筛查。
三次轴界面工程化修饰增强O型口蹄疫病毒样颗粒的稳定性
南栩;董虎;张韵;孙世琪;郭慧琛;马全英;王晓强;提高口蹄疫病毒样颗粒（FMDV VLPs）的稳定性是推动其作为疫苗广泛应用的关键。基于O型FMDV三次轴界面的结构分析，提出一种“截断-插入”改造策略：在VP2蛋白N末端截去10个氨基酸残基，并在第11位氨基酸前插入一段由6个氨基酸残基构成的迷你螺旋结构，以提升FMDV VLPs的稳定性。结果显示，改造后的突变蛋白VP0（命名为VP2mut）与VP1、VP3成功实现可溶性共表达，经酶切后成功自我组装形成VLPs（命名为VP2mut VLPs）。透射电镜观察表明，VP2mut VLPs保留了与野生型VLPs（WT O VLPs）相似的形态结构，动态光散射测定其水合直径约为30 nm。稳定性试验结果显示：VP2mut VLPs的熔解温度较野生型提高了3.2 ℃；在室温放置7 d后，其剩余完整抗原含量仍达40%，37 ℃放置3 d后，剩余完整抗原含量仍达20%以上；在pH 6.5环境中处理10 min后，剩余完整抗原含量仍高于50%。本研究成功构建了稳定性显著提升的FMDV VLPs，为后续开发高效、稳定的FMDV VLPs疫苗奠定了重要基础。
猪δ冠状病毒的分离鉴定及对哺乳仔猪被动免疫后的免疫原性分析
朱丽晶;吴国珍;申圆梦;栾庆东;翁晨曦;丁国杰;李一经;为了研究猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)流行毒株的生物学特性，制备相应针对性疫苗，本研究采集临床腹泻仔猪小肠病料，将RT-PCR阳性病料接种ST细胞进行病毒分离。对其中1株强致细胞病变分离株进行了血清学检测和形态学观察鉴定、病毒S基因遗传进化分析，并评估该分离株对仔猪的致病性。利用该毒株制备免疫原，免疫产前约45日母猪，测定所产哺乳仔猪的中和抗体水平，并对5日龄仔猪进行攻毒，测定母乳抗体的免疫保护效果。试验结果确定，分离出了1株可在体外培养的PDCoV毒株，将其命名为PDCoV-DQ。致病性试验结果表明，该分离株能够导致5日龄仔猪出现水样腹泻、精神沉郁等症状；感染后第24 小时，可在仔猪粪便中检测到病毒，攻毒发病率和排毒率均为100%。免疫母猪哺乳仔猪的中和抗体水平检测表明，仔猪在哺乳期的第28天体内存在较高水平的母源抗体。免疫攻毒试验结果表明，免疫攻毒后的发病保护率为100%，排毒率降为20%，被动免疫具有良好的保护效果。本研究提示，通过免疫妊娠母猪可以有效预防仔猪感染PDCoV。
牛结节性皮肤病病毒ORF122蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
王天敏;温渊;李超;汤芳;戴建君;薛峰;旨在制备并鉴定牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF122重组蛋白及其单克隆抗体。选取ORF122蛋白膜外功能区（68～196 aa），构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达并纯化获得重组蛋白rLSDV122；以rLSDV122免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术筛选分泌抗LSDV ORF122抗体的杂交瘤细胞株，对所得单克隆抗体进行亚型鉴定和间接ELISA效价测定，并采用免疫印迹和间接免疫荧光试验评价其对感染细胞中天然ORF122的识别能力及与常见牛源传染性病原体的交叉反应性。结果显示，成功获得相对分子质量约17 kDa的重组蛋白rLSDV122，以及2株IgG1/κ型单克隆抗体2D5和4H3，其间接ELISA终点效价分别为1∶128 000和1∶64 000。免疫学检测表明，两株单抗均能特异性识别LSDV感染MDBK细胞中的天然ORF122蛋白，且与多种牛源常见传染性病原体无交叉反应。综上，成功制备了针对LSDV ORF122的特异性单克隆抗体，为LSDV病原学研究及相关免疫诊断技术开发提供实验基础。